赵爱玲，薛晓芳，任海燕，王永康，李登科，李 毅
(山西农业大学，山西省农业科学院 果树研究所，果树种质创制和利用山西省重点实验室，太原 030031)
枣(ZizyphusjujubaMill.)是中国第一大干果树种，品种资源丰富，据报道中国现有枣种质资源900多份[1]。枣果实除含有一般营养成分外，还含有黄酮、腺苷、有机酸、三萜、维生素和生物碱等多种生物活性物质[2-7]，营养价值极高。红枣被誉为“药食同源”的传统营养滋补品，具有补气血、益脾胃、润肤养颜、抗衰延年等保健功效，倍受人们青睐。随着生活水平的提高，人们对食品的追求已逐渐转向具有合理营养和保健作用的功能性食品，越来越希望通过膳食获得某些特殊功效。进一步确知不同种质资源果实的功效成分及其含量将为资源的高效利用和人们的膳食选择提供理论基础。
糖酸组分及其含量是决定果实风味品质的重要因素[8-11]。目前，关于果实糖酸研究的报道很多[12-13]，但对于枣果实有机酸组分的研究报道较少。孙延芳等[14]分析了陕北酸枣中的酒石酸、苹果酸、柠檬酸等7种有机酸，同时建立了测定枣果中7种有机酸的 HPLC 分析方法。赵爱玲等[15]对20个枣品种中9种有机酸组分进行分析，初步明确了枣果有机酸组分的含量特征和在不同发育时期的含量变化。刘祯妍等[16]、侯丽娟等[17]也对几个枣品种果实的有机酸进行了测定分析。2019年周晓凤[18]对近年引进新疆的枣资源果实糖、酸组分进行了分析测定，基于酸组分含量，将种质资源果实酸积累划分为苹果酸积累型、奎宁酸积累型和中间型3类。已有关于枣果实有机酸研究的报道主要以方法和定性为主，对不同类型枣种质资源果实的有机酸组成和含量特征缺乏系统的分析，不能完全反映其在枣果实中的普遍规律，对种质资源多样性也不能作客观评价。因此，本研究拟通过对国家枣种质资源圃的219份枣种质资源果实的酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸7种水溶性有机酸组分的含量特征进行研究，揭示不同类型枣种质的有机酸组成存在的差异，为枣优良新品种的选育和不同用途的品种筛选提供理论依据。
1 材料与方法1.1 样品采集与处理试验于2017—2018年在山西省农业科学院果树研究所进行，选取包括野生资源、地方品种和选育品种的219份种质资源果实为研究试材(表1)。样品均采自国家枣种质资源圃，样本树为正常生长结果的成龄树，栽培条件相同，管理水平 一致。
每份种质均在果实脆熟期选取3株样本树，从树冠外围不同方向取30～50个大小均匀无病虫害的果实，采摘后当即清洗，切片，混匀后分3份分别装入塑封袋，置于-80 ℃冰箱中保存，备用。
1.2 仪器方法试验采用超高效液相色谱法测定酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸7种水溶性有机酸组分的含量。检测仪器为Waters公司UPLC ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪，数据处理系统为Empower 2，选用ACQUITY TUV 紫外检测器和ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1 mm×100 mm的酸分析柱。试验所用标准品均为Sigma公司产品。液相分析用外标法定量，单标定性，混标定量。
提取和测定均参照刘祯妍等[16]、赵爱玲等[19]的方法。用0.02 mol·L-1KH2PO4水溶液提取，取20 g冷冻果肉加80 mL提取液打浆，浆液在室温条件下超声提取20 min，先用4层纱布粗滤，滤液 10 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜后上机分析。检测流动相为甲醇和 0.02 mol·L-1的KH2PO4水溶液(H3PO4调至pH 2.38)梯度检测，检测波长210 nm，流速 0.15 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量5 μL。试验结果以鲜质量计。
1.3 数据处理采用Microsoft excel 2003和SPSS 18.0 对试验数据进行处理。对219 份枣种质果实7种有机酸组分含量的范围、中间值和分布情况进行统计分析；按各组分含量范围的种质分布情况绘制直方图，采用Shapiro-Wilk进行正态性检验，置信区间≥99%；聚类分析以奎宁酸、苹果酸、柠檬酸3种主要有机酸组分作为聚类指标，对数据进行标准化处理，选用系统聚类的方式分析，测量间距采用欧几里德距离平方和进行测量，得出聚 类树。
2 结果与分析2.1 不同种质资源枣果实有机酸组分含量以脆熟期果实分析219份不同枣种质资源有机酸组分及含量，详见表1。
表1 枣种质果实有机酸组分含量Table 1 Components and contents of organic acids in jujube germplasm μg ·g-1
(续表1 Continued table 1)
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2.1.1 总酸 果实中总酸含量为8 298.20～ 33 098.94 μg·g-1，平均值15 847.51 μg·g-1，种质间变异系数为24.13%；含量低的种质有‘蒲城圆梨枣’‘韩国月初’‘韶关大枣’‘大荔晋枣’‘太谷铃铃枣’等品种，含量高的有‘伏脆蜜’‘衡阳珍珠枣’‘保德小枣’‘北京缨络枣’‘聊城圆铃枣’等。正态性检验结果表明(图1)，219 份枣资源果实总酸含量符合正态分布(P=0.038>0.01)，79.00% 的种质含量在11 250～18 750 μg·g-1，含量在13 750～15 000 μg·g-1的频率最高，占所测种质的18.70%，含量超过30 000 μg·g-1的有2份种质，含量小于10 000 μg·g-1的有5份种质。
2.1.2 奎宁酸和苹果酸 奎宁酸含量为 1 511.00～23 271.39 μg·g-1，平均5 359.74 μg·g-1，变异系数是 61.61%。含量较低的种质有‘交城甜酸枣’‘南谷丰葫芦枣’‘临猗珍珠龙枣’‘韶关大枣’‘太谷铃铃枣’等品种，含量较高的有‘衡阳珍珠枣’‘聊城圆铃枣’‘北京缨络枣’‘乐陵无核小枣’‘保德小枣’‘官滩2号’等。正态性检验结果表明(图1)，219 份枣资源果实奎宁酸含量不符合正态分布(P=0.000 7<0.01)，其峰度和偏度在所测组分中都最高。67.00% 的种质含量在3 000～6 000 μg·g-1，含量在 4 000～5 000 μg·g-1的频率最高，占所测种质的28.31%，含量超过20 000 μg·g-1的有6份种质，15 000～20 000 μg·g-1的只有1份种质，10 000～15 000 μg·g-1的有2份种质。
苹果酸含量为2 424.14～24 525.01 μg·g-1，平均值7 636.07 μg·g-1。变异系数为29.79%，是所测有机酸组分中最小的，说明苹果酸在不同种质间的含量差异最小。苹果酸含量较低的种质有‘官滩2号’‘濮阳核桃纹’‘乐陵无核小枣’‘聊城圆铃枣’‘韩国月初’等品种，含量高的有‘伏脆蜜’‘溆浦香枣’‘溆浦圆枣’‘临猗珍珠龙枣’‘吴县水团枣’等。正态性检验结果表明(图1)，219 份枣资源果实苹果酸含量符合正态分布(P=0.158>0.01)，68.49% 的种质含量在 6 000～10 000 μg·g-1，含量在 7 000～8 000 μg·g-1的频率最高，占所测种质的24.20%，含量超过12 000 μg·g-1的有4份种质，含量小于4 000 μg·g-1的有9份种质。
在所测219份枣种质的果实中，奎宁酸/苹果酸的比值平均值是0.83，范围是0.14～7.78。不同种质按比值可分为两类。比值大于1的为奎宁酸优势型，这类种质只占所测样品的 9.58%，如‘聊城圆铃枣’‘北京缨络枣’‘乐陵无核小枣’‘官滩2号’‘衡阳珍珠枣’‘保德小枣’‘濮阳核桃纹’等。比值小于1的属苹果酸优势型，所测 90.41%的种质都属于苹果酸优势型，如‘临猗珍珠龙枣’‘伏脆蜜’‘溆浦香枣’‘南谷丰葫芦枣’‘溆浦圆枣’‘韶关大枣’‘交城甜酸枣’等。
2.1.3 酒石酸、柠檬酸和琥珀酸 酒石酸的含量为112.09～1 208.53 μg·g-1，平均347.60 μg·g-1，变异系数是41.68%。含量较低的种质有‘灌阳短枣’‘新郑大枣’‘大荔耙齿枣’‘临猗笨枣’‘溆浦砂糖枣’等，含量较高的有‘韩国月初’‘大荔干尾巴’‘沧县屯子枣’‘巷庄小酥枣’‘夏津茶壶枣’等。正态性检验结果表明(图1)，219 份枣资源果实酒石酸含量不符合正态分布(P=0.006<0.01)，含量为300～350 μg·g-1的频率最高，占所测种质的20.54%，其次是含量为 250～300 μg·g-1，占18.72%。含量超过1 200 μg·g-1的只有1份种质，800～1 000 μg·g-1的有3份种质。
柠檬酸的含量为252.60～ 9 240.07 μg·g-1，平均1 880.96 μg·g-1，变异系数是 54.94%。含量较低的种质有‘韩国月初’‘中枣1号’‘稷山圆枣’‘灰团枣’‘新郑红2号’等，含量较高的‘临猗珍珠龙枣’‘溆浦圆枣’‘大荔小圆枣’‘大荔疙瘩枣’‘南京鸭枣’等。正态性检验结果表明(图1)，219 份枣资源果实柠檬酸含量符合正态分布(P=0.309>0.01)，61.18% 的种质含量在1 200～2 800 μg·g-1，含量在1 200～1 600 μg·g-1的频率最高，占所测种质的19.63%，含量超过8 000 μg·g-1的只有1份种质，含量小于400 μg·g-1的有4份种质。琥珀酸的含量为24.60～3 387.23 μg·g-1，平均495.42 μg·g-1，变异系数是117.64%，是所测有机酸组分中最大的，说明琥珀酸在不同种质间的差异最大。琥珀酸含量较低的种质有‘彬县酸疙瘩’‘赞皇大枣’‘新郑灰枣’‘洪赵小枣’‘西营笨枣’等，含量较高的有‘献县圆小枣’‘溆浦圆枣’‘婆枣枝变1号’‘沧县屯子枣’‘大荔耙齿枣’等。另有39份种质果实中未检测到琥珀酸，如‘彬县圆枣’‘交城端枣’‘成武冬枣’‘大荔知枣’‘洪赵十月红’‘夏津茶壶枣’‘蒲城圆梨枣’等。正态性检验结果表明(图1)，180份枣资源果实琥珀酸含量不符合正态分布(P=0.000 1<0.01)，含量在500.00 μg·g-1以下的占55.25%，在167.00 μg·g-1以下的频率最高，占29.22%，含量在 2 000.00 μg·g-1以上的只有5份种质。
2.1.4 乙酸和富马酸 乙酸的含量为33.38～ 1 263.33 μg·g-1，平均341.99 μg·g-1，变异系数为 75.08%，且只有128份种质果实中可检测到。含量较低的种质有‘圆铃1号’‘平陆棒槌枣’‘大荔圆枣’‘临泽小枣’‘临潼轱辘枣’等，含量较高的有‘临黄1号’‘北京缨络枣’‘宁夏大红枣’‘枣庄小铃枣’‘新郑小圆枣’等。正态性检验结果表明(图1)，128份枣资源果实乙酸含量符合正态分布(P=0.034>0.01)，54.68% 的种质含量在100～400 μg·g-1，含量在100～300 μg·g-1的频率最高，占所测种质的37.50%，含量在400～800 μg·g-1的种质占26.56，含量在800～1 000 μg·g-1的有2份种质，含量超过1 000 μg·g-1的有4份种质。
富马酸的含量相对较低，为4.47～65.21 μg·g-1，平均18.41 μg·g-1，变异系数是 45.96%。含量较低的种质有‘历城串铃枣’‘早板枣’‘梨枣变异’‘梅花小铃枣’‘运城绵枣’等，含量较高的有‘巷庄小酥枣’‘新郑红2号’‘保德小枣’‘交城端枣’‘新郑鸡心枣’‘蒲城绵枣’等，只有‘新郑鸡蛋枣’未检测到。正态性检验结果表明(图1)，218份枣资源果实富马酸含量不符合正态分布(P=0.003<0.01)，58.26% 的种质含量为 10～20 μg·g-1，含量为13.33～16.67 μg·g-1的频率最高，占所测种质的23.85%，含量超过40 μg·g-1的只有4份种质。
2.2 枣果实有机酸的组成及占比基于对219份种质枣果实的酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸7种有机酸组分测定的基础上，分析枣果实有机酸的组成特点，结果表明(图 2)：7 种有机酸组分中苹果酸含量最高，占总酸的48.20%，其次是奎宁酸占总酸的33.38%，柠檬酸占总酸含量的11.87%，这3种酸占总有机酸的93.45%，说明枣果水溶性有机酸以苹果酸、奎宁酸和柠檬酸为主。其他组分高低依次是琥珀酸3.13%、酒石酸2.19%、乙酸2.16%、富马酸0.12%。
2.3 枣果有机酸组分的相关性分析基于所测219份种质枣果实中的酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸7种有机酸组分进行相关性分析(表2)，发现总酸与奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸的相关系数分别为0.695、0.469、0.322、0.235、0.219，与奎宁酸的相关系数最大，说明奎宁酸的含量对果实的酸度影响最大，其次是苹果酸和柠檬酸。奎宁酸与苹果酸呈极显着负相关，与柠檬酸呈显着负相关，与富马酸呈极显着正相关。柠檬酸与苹果酸、琥珀酸均呈极显着正相关，与乙酸呈显着正相关。
表2 有机酸组分的相关性分析Table 2 Correlation analysis of different components of organic acids
2.4 枣种质果实有机酸含量的聚类分析对219份种质的苹果酸、奎宁酸、柠檬酸3个主要有机酸组分进行系统聚类，结果见图3。当聚类欧氏距离取值D=7.5时，可把219份种质分为5个类群。
第一类群总酸含量较低，均值为14 006.39 μg·g-1，苹果酸、奎宁酸、柠檬酸3种有机酸的比例平均为6.5∶5.1∶1.1，包括70份种质，占所测种质的31.96%，又可分为3个组群，第一组群苹果酸和柠檬酸含量相对较高，如‘八月炸’‘合阳铃铃枣’‘河北无核’‘鲁枣4号’‘延川大白枣’等；第三组群苹果酸和柠檬酸含量相对较低，如‘大荔干尾巴’‘韩国月初’；第二组群介于二者之间。
第二类群包括69份种质，占31.51%，总酸含量均值为18 186.32 μg·g-1，苹果酸、奎宁酸、柠檬酸3种有机酸的比例平均为9.3∶5.1∶ 1.7，也可分为3个组群，第一组群奎宁酸含量相对较高，柠檬酸含量较低；第三组群苹果酸和柠檬酸含量相对较高；第二组群介于二者之间。
第三类群也包括69份种质，总酸含量也较低，均值为14 636.02 μg·g-1，苹果酸、奎宁酸、柠檬酸3种有机酸的比例平均为6.8∶4.2∶ 2.5，柠檬酸含量是第一类群的2倍多。3个组群中第一组群总酸含量相对较高，3种主要有机酸相互间的含量差异最大，且柠檬酸含量较高，均值为3 293.28 μg·g-1；第二组群3种主要有机酸相互间的含量差异最小，总酸含量也低；第三组群介于二者之间。
第四类群只包括‘大荔疙瘩枣’‘溆浦圆枣’‘临猗珍珠龙枣’和‘伏脆蜜’4份种质，这类种质属于苹果酸优势型的高酸种质，总酸均值为 27 310.42 μg·g-1，‘伏脆蜜’是所测种质中苹果酸含量最高的，其他3个都是所测种质中柠檬酸含量较高的。
第五类包括‘保德小枣’‘北京缨络枣’‘官滩2号’‘衡阳珍珠枣’‘乐陵无核小枣’‘聊城圆铃枣’和‘颖玉’7份种质，均属奎宁酸优势型的高酸种质，总酸均值为27 890.04 μg·g-1，奎宁酸均值为21 134.83 μg·g-1。
3 讨 论3.1 枣果实中主要有机酸的组成黄艳凤等[20]用GC-MS法分析山东沾化、河北黄骅、天津静海3个产地冬枣中的有机酸发现，各产地冬枣果肉中所含有机酸种类基本相同，但含量有所差异，3个产地冬枣中含量最高的都是柠檬酸。周晓凤[18]用HPLC法对新疆冬枣的分析发现冬枣中的苹果酸占比最高，其次是奎宁酸和柠檬酸。周晓凤[18]是对新疆塔里木大学枣种质资源圃的种质果实有机酸进行分析，本研究是对山西太谷国家枣种质资源圃的种质果实有机酸进行分析，所选样品中相同种质49份，其中46份种质果实的主要有机酸含量高低顺序基本一致，3份种质果实最高含量的有机酸不同。测定‘彬县黑疙瘩’、‘延川狗头枣’是苹果酸含量最高，奎宁酸次之，‘衡阳珍珠枣’是奎宁酸含量最高，苹果酸次之，而周晓凤[18]的结果正好与此相反。总之，同一种质由于地域、年度的不同所测定的有机酸结果不完全一致，这可能是土壤条件、气候特征等外界因素的影响导致有机酸积累不一样从而引起果实口感不同。另外，周晓凤[18]研究136份供试材料中84%的枣种质资源果实中未检测到琥珀酸与富马酸，本研究中219份供试材料中只有‘新郑鸡蛋枣’未检测到富马酸，琥珀酸的种质检出率也达到82.19%，除环境条件外，分析方法不同及样品采集时期、采集方位等的不一致也会导致所测有机酸结果存在一定差异。
本研究所测定的结果与赵爱玲等[15]所测相同种质的研究结果相比除多检测了乙酸和富马酸2种有机酸外，酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、山楂酸的测定结果都升高，琥珀酸比2016测定值低，但占绝对优势的有机酸依然是苹果酸为主，奎宁酸次之。这种差异除年度气候条件、水肥管理等影响外可能还与试验方法有关，2019的试验从样品采集、贮藏、前处理、提取、测定等过程都比2016年更加注意操作细节，检测条件也进行进一步优化，使得UPLC检测分离效果更好，研究者经验更丰富对色谱结果的判断更加准确。
3.2 不同种质有机酸组分的含量范围的分布本研究是对山西太谷国家枣种质资源圃的219份种质果实的酒石酸、奎宁酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸7种水溶性有机酸进行分析，总酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸都符合正态分布，酒石酸、奎宁酸、富马酸、琥珀酸不符合正态分布。周晓凤[18]2019年对新疆塔里木大学枣种质资源圃的136份种质果实的草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸和琥珀酸进行分析，发现酒石酸、奎宁酸、苹果酸符合正态分布，柠檬酸不符合正态分布。这种分析结果的差异，除样品检测值的不同还与所测种质资源数量不等有关，一般样本群体越大，分析结果越接近真实情况。
4 结 论研究通过对219份枣种质果实7种有机酸组分的系统分析，明确了枣种质资源果实的主要有机酸组分，各组分的含量范围以及不同含量种质的分布情况。按主要有机酸的组成以及总酸的含量，将所测种质分为5大类群，并筛选出一批苹果酸优势型的高酸种质和奎宁酸优势型的高酸种质以及各有机酸组分含量高的种质和缺少某种有机酸的特异种质。为枣种质资源的高效合理利用提供了理论依据，也为进一步研究枣果各有机酸的合成机理提供基础。
綬的解释
尴尬！C罗乌龙助攻又遭对手羞辱